Lọc dòng tiếp tuyến TFF kết hợp với siêu ly tâm để chuẩn bị túi ngoại bào nhỏ hiệu quả

Các túi ngoại bào nhỏ (sEV) là các túi có kích thước nano được tiết ra bởi các tế bào có chứa axit nucleic, protein, phân tử nhỏ và các thành phần khác và đóng vai trò quan trọng trong giao tiếp giữa các tế bào. các túi ngoại bào nhỏ thuộc loại exosome có nhiều điểm tương đồng với tế bào mẹ của chúng. So với các hạt nano nhân tạo, chúng có tỷ lệ thanh thải miễn dịch thấp hơn và độc tính tế bào thấp hơn, khiến chúng trở thành ứng cử viên đầy hứa hẹn như một loại thuốc mới.phương tiện vận chuyển thuốc in vivo. Hầu hết tất cả các loại tế bào đều có thể tiết ra các túi này và nghiên cứu về ứng dụng của chúng làm chất mang thuốc đang dần chuyển từ phòng thí nghiệm sang ứng dụng lâm sàng. Tuy nhiên,sản xuất quy mô lớn-vẫn là một nút thắt lớn.

 

Các phương pháp hiện nay để phân lập túi ngoại bào

Các phương pháp phân lập túi ngoại bào hiện nay bao gồmsiêu ly tâm, ly tâm gradient mật độ, sắc ký loại trừ kích thước (SEC) và kết tủa polyethylen glycol (PEG).

Kết tủa PEG mang lại năng suất cao và vận hành đơn giản, nhưng nó có liên quan đến sự ô nhiễm đáng kể bởi các protein không mong muốn. Ly tâm gradient mật độ và sắc ký-loại trừ kích thước có thể cung cấp các sản phẩm có độ tinh khiết-cao, nhưng hiệu quả của chúng tương đối thấp và các quy trình này-tốn thời gian. Siêu ly tâm được sử dụng rộng rãi, nhưng khối lượng xử lý của nó bị hạn chế bởi công suất máy ly tâm, gây khó khăn cho việc mở rộng quy mô.

 

Ứng dụng lọc dòng tiếp tuyến để tách sEV

Lọc dòng tiếp tuyến (TFF) đã được áp dụng để tách các hạt nano như liposome và vec tơ lentivirus. Trong TFF, nguyên liệu chảy tiếp tuyến trên bề mặt màng, giúp giảm tắc nghẽn màng và giúp quy trình mở rộng dễ dàng hơn.

Vì các túi ngoại bào nhỏ thường có phạm vi từ30–200nmđường kính, mộtBăng màng 0,45 μmcó thể được chọn trong hệ thống TFF để loại bỏ các protein và túi lớn hơn, trong khiCassette màng 300 kDacó thể được sử dụng để loại bỏ các protein có trọng lượng phân tử nhỏ{0}}và tập trung các túi ngoại bào nhỏ có trong môi trường nuôi cấy.

 

Đặc tính của nguyên liệu thô sau khi tách TFF

Phân tích theo dõi hạt nano (NTA) cho thấy đường kính hạt chủ yếu được phân bố trong phạm vi0–250nm.

 

 

Tuy nhiên, kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) cho thấy một lượng lớn protein gây ô nhiễm, trong khi không quan sát thấy các túi ngoại bào. Những kết quả này chỉ ra rằng cần phải có thêm một bước thanh lọc xuôi dòng để làm sạch thêm các túi ngoại bào.

 

Đặc tính của tinh chất TFF sau siêu lọc 100 kDa

Chất cô đặc TFF được xử lý tiếp bằng cách sử dụngỐng siêu lọc 100 kDa.

NTA cho thấy đường kính hạt trong các chất cô đặc thu được sau một và hai vòng siêu lọc vẫn chủ yếu nằm trong phạm vi0–250nm. Tuy nhiên, thực hiện siêu lọc hai lần dẫn đến giảm đáng kể số lượng hạt thu được.

Phân tích TEM cho thấy rằng không quan sát thấy cấu trúc giống như túi-trong các chất cô đặc siêu lọc một-một hoặc hai-lần, trong khi vẫn còn một lượng đáng kể protein gây ô nhiễm.

Vì thế,Siêu lọc 100 kDa không thể được sử dụng một cách hiệu quả để làm sạch môi trường nuôi cấy sau khi cô đặc TFF.

 

 

Đặc tính của cô đặc TFF được tinh chế bằng siêu ly tâm

NTA cho thấy đường kính hạt của sản phẩm tinh khiết chủ yếu phân bố trong khoảng0–250nm.

Điều quan trọng là TEM đã bộc lộ rõ ​​ràng các cấu trúc giống như túi-trên các trường quan sát khác nhau. Những kết quả này chứng minh rằng sau khi cô đặc môi trường nuôi cấy bằng TFF,siêu ly tâm sau đó có thể được sử dụng để tiếp tục tách và tinh chế các túi ngoại bào.

 

 

Đặc tính của sEV được phân lập từ môi trường điều hòa tế bào gốc trung mô sử dụng TFF kết hợp với siêu ly tâm

NTA cho thấy đường kính hạt của sản phẩm tinh khiết chủ yếu phân bố trong khoảng0–250nm.

Các cấu trúc giống mụn nước-được quan sát bằng TEM. Phân tích Western blot đã chứng minh sự biểu hiện tích cực của các protein liên quan đến túi ngoại bào-CD9, CD63 và ALIXtrong các túi ngoại bào được làm sạch.

Những kết quả này xác nhận rằng các túi ngoại bào nhỏ đã được tinh chế có chứa exosome, cho thấy phương pháp này cũng có thể được sử dụng đểphân lập và chiết xuất exosome.

 

 

Kết luận: TFF kết hợp với siêu ly tâm để chuẩn bị sEV chất lượng cao-

Nghiên cứu đã chứng minh rằngriêng nồng độ TFFdẫn đến sản phẩm chứa một lượng đáng kể các protein gây ô nhiễm và do đó không đủ để thu được các túi ngoại bào đủ tiêu chuẩn.

Tương tự, sử dụng mộtỐng siêu lọc 100 kDa để lọc thứ cấpkhông mang lại hiệu quả cấu trúc túi nguyên vẹn.

Bằng cách kết hợp nồng độ TFF với quá trình tinh chế siêu ly tâm tiếp theo, những ưu điểm của cả hai kỹ thuật có thể được tích hợp để thu đượcsản phẩm túi ngoại bào nhỏ-chất lượng cao.

So với chỉ riêng siêu ly tâm thông thường, quy trình kết hợp có thể hiệu quảgiảm thời gian xử lý tổng thể và nâng cao hiệu quả phân tách.

Trong quy trình làm việc này,TFF cho phép làm giàu nhanh chóng-các mẫu có khối lượng lớn, giải quyết hạn chế của siêu ly tâm thông thường trong việc xử lý khối lượng mẫu lớn. Sau đó, quá trình siêu ly tâm thực hiện quá trình tinh chế sâu để loại bỏ các tạp chất protein đồng{1}}đậm đặc đồng thời giúp duy trì độ tinh khiết và tính toàn vẹn của các túi.

Hơn nữa, quá trình này không yêu cầu bổ sungthuốc thử kết tủa hóa học ngoại sinh, giúp duy trì hoạt động sinh học của mụn nước ở mức độ lớn nhất có thể.

Từ góc độ dịch thuật công nghiệp, quá trình này có ý nghĩa quan trọngmở rộng-tiềm năngvà có thể giúp giải quyết những thách thức liên quan đến-việc sản xuất các túi ngoại bào ở quy mô lớn chophân phối thuốc, y học tái tạo và phát triển sản phẩm liên quan. Nó cũng cung cấp cơ sở thử nghiệm vững chắc cho việc tối ưu hóa quy trình tiếp theo và sản xuất ở quy mô-thử nghiệm.

 

Thẩm quyền giải quyết

Wang Ling, Li Mengshi, Xu Sha, và những người khác.Thiết lập phương pháp tách các túi ngoại bào nhỏ bằng phương pháp lọc dòng tiếp tuyến kết hợp với siêu ly tâm. Tạp chí sinh học Trung Quốc, 2022, 35(9): 1096–1101. DOI: 10.13200/j.cnki.cjb.003713.